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 ［原理］

在動物胰臟中除了存在胰蛋白酶外，還有另外兩種與胰蛋白酶性質相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。在胰蛋白酶提取過程中，三者彼此很難分開。需采用合適的方法進一步分離純化。

從動物胰臟中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸將胰腺細胞中含有的胰蛋白酶原提取出來，然后根據等電點沉淀的原理將提取液的pH值調至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出來。經硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀。沉淀物經水溶解并調至pH8.0，用極少量的胰蛋白酶將胰蛋白酶原激活，同時溶液中的胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原也被激活，三種酶原相互作用過程如下：

也可采用從胰臟中提取出胰蛋白酶原，利用合適的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通過溶液中Ca2+的環境，使胰蛋白酶原被開始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，轉變為具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及彈性蛋白酶原亦同時被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。

激活后的酶溶液再進一步分離純化。

［試劑和器材］

1、試劑

（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液

（2）10%（體積分數）乙酸

（3）2mol/L硫酸

（4）固體硫酸銨

（5）無水CaCl2

（6）結晶胰蛋白酶

（7）25%乙醇溶液(含 0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)

（8）95%（體積分數）乙醇

（9）5mol/Ｌ NaOH

（10）丙/酮

2、器材

（1）胰臟

（2）組織搗碎機

（3）離心機

（4）磁力攪拌器

（5）透析袋、20目篩網、紗布、水浴鍋

（6）燒杯、量筒、刻度吸管、試管、玻璃漏斗

（7）布氏漏斗、抽濾瓶、溫度計、滴管、玻璃攪棒、紗布、pH試紙等

［方法和步驟］

方法一

1、 胰蛋白酶原的提取

取新鮮胰臟約150g，剝去結締組織和脂肪，取凈重100g，切成碎塊，在組織搗碎機中搗碎，并加入2倍體積預冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成勻漿。漿液倒入500mL燒杯中，用10%（體積分數）乙酸調節pH在2.5～3.0之間，在5～10℃下提取6h以上，并間隙輕輕攪拌。用4層紗布過濾，盡量擠出濾液。組織殘渣中再加入0.5倍體積（約50mL左右）預冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4層紗布過濾。合并兩次濾液，用2.5mol/L硫酸調節濾液pH在2.5～3.0之間，4℃放置4h（pH始終保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折疊濾紙于玻璃漏斗中自然過濾，收集濾液，量取體積（約200mL左右）。

濾液中加入粉末狀固體硫酸銨，使溶液達 0.75飽和度（每升濾液加492g，5℃）。放置過夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽濾，棄濾液，壓緊并收集濾餅，即胰蛋白酶原粗品。

2、 胰蛋白酶原的激活

將胰蛋白酶原粗品稱重（濕重），分次加入10倍體積預冷的蒸餾水（按濾餅重量計算），使濾餅完全溶解（一般情況濾餅中硫酸銨含量約占餅重1/4）。用5mol/L NaOH將溶液調至pH8.0，慢慢地攪拌下加入固體無水CaCl2使溶液的Ca2+終濃度達到0.1mol/L（要減去一部分氯化鈣與硫酸銨結合生成硫酸鈣的鈣離子）。取出2mL溶液用于測定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中加入5mg結晶胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。每隔1h取樣測定胰蛋白酶活性增長情況，直至酶激活速度變慢或停止增長。一般比活可達到3 500～4 000 BAEE單位/mg。留取2mL溶液用于測定激活后的蛋白質含量和酶活性。激活酶溶液用2mol/L硫酸調pH至 2.5～3.0，濾紙過濾，濾去硫酸鈣沉淀，收集濾液，4℃保存備用。

方法二

稱取冷凍豬胰臟100g，在2～5℃下解凍，切成小塊，用組織搗碎機中絞碎成胰漿，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。胰漿中加入25%（質量分數）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加 0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2），搗碎機中搗碎1min。胰漿倒入500mL燒杯中，間隙攪拌，溫度20℃左右，活化5～6h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于測定激活后的蛋白質含量和酶活性。

活化反應結束后，胰漿 3 500 r/min離心20min，將離心后上清液用二層紗布過濾。濾液置250mL燒杯中，以過濾清液的體積為準，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使溶液硫酸銨飽和度為20%。放置 6h后，3 500 r/min離心20min，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分別用適量95%乙醇洗滌過濾，再用丙酮洗滌，過濾。最后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。

在上述離心上清液中，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使上清液溶液達到55% 硫酸銨飽和度，放置 6h后，3 500 r/min離心30min，取離心沉淀，分別用適量95%乙醇、丙酮洗滌，過濾后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。