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背景

細菌培養基的光密度（OD）測定是微生物學中使用的一種常見技術。研究人員主要依靠分光光度計來進行這些測定，然而實際上這個測定是基于培養基的光散射量而不是光吸收量。在其標準配置中，分光光度計并未對光散射測定進行優化，這通常會導致儀器間所測得吸光度上的差異。

方法

該研究調查了不同的分光光度計光學配置對在分批培養基中生長的大腸桿菌JM109光密度測定的影響。分光光度計檢測包括了使用陣列檢測的反向光學系統、基于單色器的傳統系統以及一種配備積分球配件（ISA）的單色器系統。在每個儀器上測定OD600生長曲線，同時，對McFarland進行CFU/mL計數來進一步對每個光學系統進行鑒定。

結果

來自相同光學配置類別的分光光度計其OD數據是相當的。用反向光學系統測定較高OD時數據變化更大，這是由較低雜散光所導致。基于單色器的系統測試較高OD時準確度較高，主要是因為與來自反向光學系統的多色光相比，單色光具有更好的雜散光去除能力。然而，反向光學系統測定OD時卻有具有良好的動態范圍。使用ISA產生出的數據與用其它系統產生出的數據不同，這是因為其具有捕捉幾乎所有前向散射光的能力。而對McFarland標準品的測定確認了這些現象。

結論

分光光度計進行可靠的光散射測定的能力在很大程度上取決于其光學配置；因此，具有不同光學配置的分光光度計會呈現出不同的OD測定值。理想狀態下，高度散射樣品（如細胞培養基）的吸光度是使用ISA進行測定的，目的是為了捕捉幾乎所有的散射光。培養基生長可使用OD600測定，然而每當改變分光光度計時，就應該計算和應用一個換算因數。

引言

培養基中細菌生長（遲緩期、對數生長期、穩定生長期和衰亡期）各個階段都能記錄下來，其中對數期被認為是細菌分裂最快的階段（1）。使用分光光度計測定細菌培養基在600nm（OD600）時的光密度，從而監控細菌生長一直是微生物學中的一種核心技術。使用細菌OD600的三種更為常見的應用如下：（a）在細菌表達蛋白質時，找到誘導蛋白的最佳時間，（b）用于最小抑菌濃度（MIC）實驗的接種體濃度的確定和標準化，和（c）收獲和制備感受態細胞的最佳時間的確定。研究人員繼續依靠分光光度計進行這些OD測定。然而，光密度不是一個吸光度指標，而是細菌混懸液的一種光散射指標，將其自身作為吸光度顯示（圖1）。分光光度計光學配置對光密度測定的影響得到了很好的記錄（2-4）。具有不同光學配置的儀器對同一細菌混懸液測定得到了不同的光密度。分光光度計光學配置上的差異對觀察到的差異影響最大。前向光學系統采用單色光來進行吸光度的測定，而反向光學系統則利用多色輻射進行測定，光在其穿過樣品后再區分成單獨波長（圖2）。前向光學系統的一些要素導致了測得OD值上的差異：（a）樣品與檢測器之間的距離，（b）聚光透鏡的尺寸和焦距大小不同，和（c）檢測器的面積和靈敏度（5）。盡管現在都知道不同的光學配置會產生不同的OD值，但是研究人員仍繼續關注在不同分光光度計間發現的OD值差異。在本研究中，我們分析了多種光學配置分光光度計測出的OD值差異。我們在分批培養基中培養大腸桿菌JM109，并監控OD達9.5小時。在測定之前稀釋培養基，并將由于不同分光光度計光學元件差異造成的不同OD值進行換算。

結果

從未稀釋和稀釋的培養基中收集的OD600數據如圖3所示。將來自稀釋溶液的OD600值乘以稀釋因數，并與未稀釋的樣品進行對比。兩張圖的分歧表明，不同的光學配置在光密度測定方面會有不同的動態范圍。當對比每個分光光度計的校正OD值與細胞計數時，我們發現，隨著時間的推移，具有相似光學系統的儀器產生了相似的OD曲線（圖4）。具有前向光學系統，但卻是雙光束光學幾何結構的BioMate 3S，與儀器組的差異最大。McFarland數據呈現出一種與大腸桿菌生長相似的曲線（圖5）。ISA使用McFarland標準品產生了更低的光密度（圖6）。

圖1結論

·計算OD測定值時，確定您所用分光光度計的光密度性能和動態范圍是至關重要的。為獲得有關生長曲線的最準確信息，稀釋細胞混懸液是很重要的。

·OD測定在很大程度上取決于光學系統和幾何學。對于相同的混懸液，具有不同光學系統和配置的分光光度計會讀出不同的OD值。例如，在反向光學系統Evolution Array和前向光學系統，雙光束BioMate 3S之間有實質性的分歧。

 ·積分球配件（ISA）可捕捉幾乎所有的前向散射光，從而產生了更低的光密度。這是因為通常看起來被

樣品吸收的散射光實際上是被ISA配件所收集。ISA對測定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之選；然而，在測定細胞混懸液的光密度時，其是無效的。

·最后，我們提出了如何計算一個可用于使OD數據標準化，以便能在不同分光光度計間進行適當比較的換算因數。值得注意的是，這個換算因數是針對一種特定的有機體，因為微粒的尺寸和形狀會影響換算因數。

分光光度法中的光散射

致。

B 在一個散射樣品中（如一種細菌混懸液），到達檢測器的光會因光散射而進一步減少。到達檢測

器光的減少造成了樣品吸光度增

長的錯覺。

圖2前向和反向光學系統之間的差

異

在前向光學系統中