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溴化乙錠Taq 延伸 PCR 添加劑Tween2010% 溶液dNTP 溶液PCR 緩沖液熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶引物

無(wú)菌槍頭瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備和試劑

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

溴化乙錠

Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagene)

Tween20，10% 溶液

2. 酶和酶緩沖液

dNTP 溶液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 25 mmol/L)

PCR 緩沖液，10X, 用戶買(mǎi)熱穩(wěn)定聚合酶時(shí)公司一并提供，或者 PCR 優(yōu)化緩沖液，比如，Opti-Prime PCR 優(yōu)化試劑盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)

熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)

3. 核酸和寡核苷酸

可選擇：插入物特異的引物（在雙向克隆中用來(lái)確定插入物的方向）

一套篩選重組體的引物

4. 專(zhuān)用設(shè)備

用于劃板和接菌的無(wú)菌槍頭

用槍頭代替牙簽，是因?yàn)檠篮灴赏ㄟ^(guò)毛細(xì)作用帶走液體，因此會(huì)改變反應(yīng)混合物的濃度。

5. 額外項(xiàng)目

瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備和試劑，包括溴化乙錠

二、方法

1. 根據(jù)反應(yīng)數(shù)目或要做的 PCR 反應(yīng)的管數(shù)，在冰上用一個(gè)離心管像調(diào)雞尾酒一樣準(zhǔn)備

PCR「雞尾酒」式混合物，按如下順序依次加入各種成分。

H₂O 將終體積補(bǔ)充到 25ul

Taq 緩沖液，10X                                                          2.5ul

Tween20(體積分?jǐn)?shù) 10% 溶液）                                   1.0ul

dNTP 混合物（每種 dNTP 為 25 mmol/L)                     0.2ul

重組體篩選引物套（100ng/ul)                                     1ul

Taq 延伸 PCR 添加劑（5U/ul)                                     0.25ul

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)                                              0.25ul

2. 在冰上，分裝"雞尾酒"式 PCR 混合物到每一個(gè) PCR 試管中，每管移取 25ul。

3. 對(duì)照反應(yīng)中，加入 1ul 的非重組 DNA。
可以選擇：對(duì)于用來(lái)確定插入方向的反應(yīng)，向恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)管中加入第三個(gè)插入物特異的引物。

4. 對(duì)于重組篩選，用一個(gè)無(wú)菌槍頭刺挑一下轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的菌落，然后在相應(yīng)的反應(yīng)管中攪動(dòng)菌落物質(zhì)。在給每一個(gè)反應(yīng)混合物接種后，迅速地移走槍頭，并在含有抗生素平板上輕涂以留菌種，以備后續(xù)分析。對(duì)于 PCR 介導(dǎo)的重組篩選，也可參考下面的疑難解答。

5. 輕輕混勻每個(gè)反應(yīng)體系。

6. 用推薦的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行 PCR。

7. 用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物。推薦用 10~15 g/L 瓊脂糖凝膠來(lái)優(yōu)化分辨500~6000bp 的 PCR 產(chǎn)物。通常，取 1~5ul PCR 產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色后分析。可以通過(guò)傳統(tǒng)的瞬間成像技術(shù)或計(jì)算機(jī)圖像軟件來(lái)獲取圖像。