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本文以中國藥典的HPLC方法為起點，利用快速高分離度液相色譜（RRLC）對西洋參中活性組分Rg1、Re、Rb1進行快速、有效的分離。該方法在保持分離度和重現性的前提下，改善了分析靈敏度，大大縮短了分離時間。另外，使用相同RRLC系統和與RRHT色譜柱相同鍵合相的ZORBAX SB C18 HPLC色譜柱，也獲得了滿意的HPLC分離結果。

概述

西洋參（又名花旗參）系五加科植物西洋參（Panax quinquofolimm L.）的干燥根，西洋參的根部及地上莖葉部分含有多種生理活性成分，其中主要是西洋參皂甙和三萜類化合物，三萜類化合物與人參皂甙結構相似。西洋參皂甙是西洋參中主要的有效成分，也是生理活性最顯著的物質。其中人參皂苷的Rb1又是西洋參主要特征成分，其含量高于人參，也是西洋參與人參鑒定的主要依據。

在2005版中國藥典一部中，西洋參活性成分的含量測定采用了以十八烷基鍵合硅膠為填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫的液相色譜分析方法。該方法主要需要分離人參皂苷Rg1、Re與Rb1，因3個化合物結構相似，尤其是Rg1和Re（見圖1），故HPLC需要利用長時間的淺梯度分離。3個色譜峰的HPLC分離時間需要約60min，分離一次的運行時間長達120min。本研究是在中國藥典HPLC梯度方法的基礎上，選擇合適的鍵合相填料，開發以小顆粒填料技術為基礎的RRLC方法，在滿足分離度要求的前提下，實現快速、靈敏、可重現的方法學目標。

圖1  人參皂苷的結構

在2005版中國藥典一部中，西洋參活性成分的含量測定采用了以十八烷基鍵合硅膠為填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫的液相色譜分析方法。該方法主要需要分離人參皂苷Rg1、Re與Rb1，因3個化合物結構相似，尤其是Rg1和Re（見圖1），故HPLC需要利用長時間的淺梯度分離。3個色譜峰的HPLC分離時間需要約60min，分離一次的運行時間長達120min。本研究是在中國藥典HPLC梯度方法的基礎上，選擇合適的鍵合相填料，開發以小顆粒填料技術為基礎的RRLC方法，在滿足分離度要求的前提下，實現快速、靈敏、可重現的方法學目標。

RRLC方法轉換和優化

快速高分離度液相色譜（RRLC， Rapid Resolution Liquid Chromatography）利用亞二微米小顆粒填料分離的液相色譜技術，與常規較大顆粒（如5mm）不同，小顆粒可以顯著改善液相色譜的分離度、分離速度和靈敏度。因RRLC分離常常使用與HPLC不同的儀器和色譜柱，故在RRLC分離時需要對原始HPLC分離條件進行適當的調整或優化。

色譜柱的選擇

因流動相中含有磷酸，RRLC分析采用內含1.8小顆粒的ZORBAX StableBond C18色譜柱。該填料在低pH條件下具有杰出的穩定性，是低pH條件液相色譜分離的首選。色譜柱規格選擇了4.6×50mm的RRHT色譜柱，其柱長與粒徑之比（L/dp≌28）與規格為4.6×150 mm， 5的常規HPLC色譜柱相當（L/dp=30），故可以獲得相近的分離效率，但分離速度大大提高，并且可以改善靈敏度。

色譜柱內徑的選擇主要考慮方法轉換的方便性，選擇與HPLC色譜柱相同內徑的RRHT色譜柱可以降低方法轉換的可變性。本方法采用了與HPLC色譜柱相同內徑（4.6mm）的RRHT色譜柱。如選用更小內徑的色譜柱，可以在保持線速度相同的前提下獲得相同的分離結果，并進一步降低溶劑消耗。

方法轉換的初步參數確定

在Method Translator相應欄目中輸入原始HPLC條件，包括HPLC色譜柱規格、進樣量、流速、梯度表等參數，并選擇RRLC色譜柱的規格，即可獲得根據洗脫柱體積相同原則折算而得的RRLC分離的初步參數。

因小顆粒填料在較高的線速度下可以保持柱效（分離度），故可以通過提高流速的方式進一步提高分離速度。如需保持分離度相同，則在流速調整時要保持流速與梯度時間乘積不變，即提高流速的同時等比縮短梯度時間。本研究根據中國藥典一部中給定的西洋參梯度分離條件和上述原則，確定了初始實驗條件。

方法優化

起始試驗條件雖然獲得了與藥典原始HPLC方法相似的RRLC分離譜圖，但因色譜柱選擇性的差異等影響，并沒能基線分離結構相近的目標化合物Rg1與Re。因此，方法需要進行進一步摸索與優化。適當降低流動相在Rg1與Re出峰附近的洗脫強度，兩色譜峰的分離度獲得了初步改善，但仍未實現基線分離。考慮到溫度對分離選擇性的可能影響，嘗試設置不同柱溫考察分離選擇性的變化。原始中國藥典的方法所用柱溫為40℃，本實驗在原始條件的基礎上，又分別在25℃和30℃下進行了分離（見圖2）。

圖2  不同溫度下，Rg1與Re的分離度比較

從實驗結果得知：降低溫度有利于Rg1與Re的分離，25℃時Rg1和Re可以得到基線分離（分離度>2.0）（見圖3），故最終選擇25℃為柱溫條件。最終優化獲得的分離條件可以在11min內基線分離3個目標皂苷（分離度>2.0），加上洗脫保留較強雜質與平衡時間，一次運行總時間為20min，分離速度是原來HPLC分離速度（120min）的6倍，溶劑消耗也相應降低了。

圖3  西洋參中人參皂苷的RRLC分離結果

RRLC色譜條件

系統：Agilent 1200快速高分離度液相色譜（RRLC），包括：在線脫氣機（G1379B），SL型二元泵（G1312B），SL型自動進樣器（G1367C），SL型柱恒溫箱（G1316B）和SL型二極管陣列檢測器（G1315C）。

檢測池：2μl
峰寬：0.01min（0.2s）
狹縫：4nm
進樣器后管線內徑：0.12mm（Seat Capillary為0.17mm）
色譜柱：ZORBAX SB C18 RRHT色譜柱，4.6×50mm，1.8
流動相：A為0.1%的H3PO4，B為乙腈，梯度分離
柱溫：25℃
流速：2ml/min
檢測波長：203nm
進樣量：5μl

RRLC分離的梯度重現性

使用RRLC系統進行快速分離不僅可以獲得速度、分離度與靈敏度的改善，同時可以保持液相色譜分離技術的杰出重現性（見圖4）。

圖4  西洋參分析中RRLC梯度分離的重現性，色譜條件同圖3

RRLC和HPLC的轉換

RRLC的良好兼容型與靈活性，使用戶可以根據需要在同一儀器硬件上靈活使用常規HPLC色譜柱和RRLC色譜柱。而鍵合相品牌豐富的ZORBAX RRHT色譜柱（如SB、XDB、Extend、Eclipse Plus等），又為相同品牌、不同粒徑填料之間方法的相互轉換提供了便利條件，使RRLC與HPLC之間方法的相互轉換非常方便。基于現有RRLC分離條件，也可以非常容易地獲得相應HPLC的分離方法。只需用Method Translator將參數進行直接轉換，即可獲得根據RRLC方法優化參數相應的HPLC條件參數。本研究使用相同的RRLC系統和HPLC色譜柱，獲得了分離選擇性與RRLC幾乎完全相同的HPLC分離結果（見圖5）。

圖5  西洋參分析中HPLC與RRLC分離色譜圖比較

值得注意的是：與RRLC相比，HPLC在相同進樣量時獲得的色譜峰高較低，故相對靈敏度較低。同時，分離時間也大大加長，溶劑消耗亦相應提高。

討論與結論

－中國藥典的藥物分析方法中并未指定色譜柱品牌。而不同品牌、相同鍵合相的色譜柱又存在不同的選擇性差異，故直接應用藥典方法時往往需要對方法進行調整或優化，尤其是對于復雜樣品的分離而言。使用小顆粒短柱的RRLC分離可以顯著加快分離速度，故可以大大縮短方法開發和優化過程所需的時間。如此獲得的RRLC分離條件，又可以簡單方便地轉換成常規HPLC方法，并在RRLC系統上實現HPLC分離。所以，使用RRLC系統進行分離會大大提高工作效率。

－RRLC分離不僅可以大幅度縮短分析時間，而且能夠降低溶劑消耗。

－RRHT色譜柱擁有與常規HPLC內徑相同的4.6mm色譜柱，使之可以接近或保持與HPLC相同的進樣量。與HPLC相比，在保持相同進樣量的前提下，使用小顆粒填料的RRLC可以顯著改善分離靈敏度。

－RRLC可以在快速分析中仍然保持出色的分離重現性。

－不同色譜柱具有不同的選擇性，因而可以造成方法轉換中的分離狀況變化。選擇具有相同鍵合相品牌的不同顆粒色譜柱，會簡化HPLC與RRLC方法之間相互轉換中的參數優化過程。ZORBAX系列RRHT色譜柱涵蓋了非常豐富的鍵合相品牌，如SB、XDB、Eclipse Plus、Extend等，方便用戶靈活選擇與HPLC相同品牌鍵合相的小顆粒填料。

－溫度對色譜柱選擇性的調節作用不可小視。RRLC具有制冷功能的柱溫箱，不僅溫度控制范圍寬（室溫以下15～100℃），而且控溫精確高（±0.05℃），即便在室溫以下亦能精密控溫。快速、精確的溫度調節與控制能力，不僅保證了分離的保留時間重現性，而且為用戶利用溫度進行選擇性調節提供了極大的便利。

色譜條件
色譜柱：ZORBAX SB C18 4.6×150mm，5
流動相：A為0.1%H3PO4，B為乙腈，梯度分離
流速：1ml/min
其它條件同圖2。